Ekspresi Prethrombin-2 Manusia Recombinan dalamPichia pastoris dan Optimasi Kondisi Ekspresinya

Shabarni Gaffar; Purba Upay; Iman Permana Maksum; Khomaini Hasan; Toto Subroto; Sutarya Enus; Soetijoso Soemitro; Wulan Pertiwi

doi:10.15416/ijpst.v4i1.9766

Ekspresi Prethrombin-2 Manusia Recombinan dalamPichia pastoris dan Optimasi Kondisi Ekspresinya

Shabarni Gaffar, Purba Upay, Iman Permana Maksum, Khomaini Hasan, Toto Subroto, Sutarya Enus, Soetijoso Soemitro, Wulan Pertiwi

Abstrak

Pretrombin merupakan prekursor dari trombin yang memiliki aktivitas proteolitik. Trombin merubah fibrinogen menjadi benang fibrin yang salah satu aplikasinya adalah dapat digunakan sebagai lem untuk menggantikan teknik jahitan pasca bedah. Aplikasi trombin untuk pembuatan lem fibrin menuntut diproduksinya trombin rekombinan. Tujuan dari penelitian ini adalah ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia rekombinan menggunakan sistem ekspresi Pichia pastoris. Gen pengode PT2 dirancang sesuai
dengan kodon preferensi P. pastoris. Fragmen PT2 diamplifikasi dengan metoda PCR dengan penambahan sisi restriksi EcoR1 pada ujung 5’ dan sisi restriksi SacII pada ujung 3’. Produk PCR yang berukuran 924 pb diligasi dengan vektor ekspresi pPICZaB untuk P. pastoris dan disubkloning dalam inang Escherichia coli. Urutan nukleotida dikonfirmasi dengan metoda dideoxy Sanger. Plasmid rekombinan pPICZaB-PT2 kemudian digunakan untuk mentransformasi P. pastoris SMD1168 defisien protease dengan metoda elektroporasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen PT2 berhasil diamplifikasi dan dikloning dalam E. coli. Analisis restriksi dan penentuan urutan DNA menunjukkan bahwa PT2 rekombinan 100% homologi dengan hasil rancangan. Hasil ekspresi PT2 oleh P. pastoris menggunakan metanol sebagai inducer memperlihatkan bahwa PT2 dengan berat molekul 35 kDa berhasil diekspresikan. Optimasi kondisi ekspresi melalui variasi konsentrasi metanol sebagai inducer dan sorbitol sebagai sumber karbon tambahan menunjukkan bahwa metanol 2% dan sorbitol 2% merupakan kondisi optimum ekspresi PT2.

Teks Lengkap:

PDF

Referensi

Giulia Russo, Alain Gast, Ernst-Jurgen Schlaeger, Antonietta Angiolillo, and Concetta Pietropaolo. Stable Expression and Purification of a Secreted Human Recombinant Prethrombin-2 and Its Activation to Thrombin. Protein expression and purification. 1997;10, 214-225.

Crawley, JT, Zanardelli, S, Chion, CK, Lane DA. 2007. The central role of thrombin in hemostasis.J Thromb Haemost: 5 Suppl 1:95-101. DOI:10.1111/j.1538-7836.2007.02500.x

Pozzi N, Chen Z, Zapata F, Pelc LA, Barranco-Medina S, Di Cera E. Crystal structures of prethrombin-2 reveal alternative conformations under identical solution conditions and the mechanism of zymogen activation. Biochemistry. 2011;50(47):10195-202. doi: 10.1021/bi2015019.

Di Cera E.Thrombin as procoagulant and anticoagulant.J Thromb Haemost;5 Suppl. 2007;1:196-202.

Di Cera E. 2008. Thrombin.Mol. Aspects Med;29(4):203-54. doi: 10.1016/j.mam.2008.01.001.

Bishop P.D, Lewis K.B, Schultz J , Walker K.M. 2006. Comparison of Recombinant Human Thrombin and Plasma-Derived Human α-Thrombin. Semin ThrombHemost;32: 086-097DOI: 10.1055/s-2006-939558.

Cereghino J.Land J. M. Cregg. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol. Rev. 2000;24: 45-66.

Daly, R.& Hearn,M.T.W. Expression fo heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 2004;18: 119-138.

Watanabe, H., Yamasaki, K., Kragh-Hansen, U., Tanase, S., Harada, K., Suenaga, A., Otagiri, M. In vitro and in vivo properties of recombinant human serum albumin from Pichia pastoris purified by a method of short processing time. Pharm. Res. 2001;18, 1775–1781.

Hardy, E., Martínez, E., Diago, D.,Díaz R., González, D., and Herrera L. Large-scale production of recombinant hepatitis B surface antigen from Pichia pastoris. J. Biotechnol. 2000;77, 157–167.

Invitrogen, A manual of methods for expresion of recombinant proteins in Pichia Pastoris, 2006. California.

Shabarni-Gaffar , Permana D, Rahmawati DP , Meirina TN, Syihab ABMI, Ismayana S, Subroto T, Suprijana O, Soemitro S. Effectof methanol inducer concentration and carbon source sorbitol and mannitol to the production of Saccharomycopsisfibuligera R64 α-amylase in Pichiapastoris. Indonesia J Appl Chem. 2011; 13(2): 58-64.

Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. Protein measurement with Folin Phenol Reagent. J Biol Chem. 1951;193, pp. 265-275.

Inan, M., Meagher, M.M. Nonrepressing carbon sources for alcohol oxidase (AOX1) promoter of Pichia pastoris. J. Biosci. Bioengng. 2001; 92: 585–589.

DOI: https://doi.org/10.15416/ijpst.v4i1.9766